۱-۱- منشاء

میخک با نام علمی Dianthus caryophyllus L. یکی از گیاهان بسیار قدیمی است و پیشینه کشت و کار طولانی دارد (خلیقی، ۱۳۸۰). عقیده براین است که میخک بومی نواحی مدیترانه است (لارسون، ۱۳۷۵). میخک‌ها بومی نواحی سرد کوهستانی از جنوب اروپا تا هند می‌باشند. گونه‌های بومی آن تنها در فصل بهار به علت افزایش دما و طول روز گل می‌دهند (لارسون، ۱۳۷۵، Tutin et al, 1993). ارقام جدید میخک ویژگی پیوسته گلدهی^[۲] داشته و در شمال‌غربی اروپا و آمریکای شمالی و در مناطق مدیترانه‌ای در گلخانه‌های پلاستیکی بدون سیستم گرمایش برای تولید گل بریدنی پرورش داده می‌شوند (Bunt and Cockshull, 1985) هم‌چنین در مناطق استوایی در صورت مناسب بودن عرض جغرافیایی که موجب کاهش دمای هوا می‌شود (مانند کلمبیا و کنیا) می‌تواند کشت شود (Bunt and Cockshull, 1985). بشر از قرن شانزدهم روی میخک بومی کار بهنژادی انجام داده است. بهنژادی برای پیوسته گلدهی نژاد میخک در سال ١٨۴٠ در فرانسه انجام و در سال ١٨۵٢ در آمریکا معمول شد. معروف‌ترین ارقام خارجی میخک از رقم ’William Sim‘ که در سال ١٩٣٨ یا ١٩٣٩ توسط ویلیام سیم تولید گردید، بدست آمده‌اند (خلیقی، ۱۳۸۰). میخک‌های امروزی شباهت بسیار کمی به اسلاف خود دارند. این میخک‌ها در تمام طول سال گل می‌دهند و دارای ساقه‌های بلند و محکم با گل‌های درشت و پُر پر و رنگ‌های گوناگون می‌باشند (لارسون، ۱۳۷۵).

۱-۲- اصطلاح‌شناسی^[۳]

در حدود ٣٠٠ سال پیش از میلاد مسیح تئوفراستوس^[۴] در باره میخک مطالبی نوشته است که ترجمه آن از زبان یونانی گل خدایان^[۵] معنی می‌دهد که دلیل نامگذاری آن بوی خوش این گل است. نام زیرگونه‌های گونه caryophyllus به احتمال منشعب از واژه Coronation (تاجگذاری) می‌باشد، شاید به آن جهت که در اساطیر یونان تاج گلی از این گیاه برای قهرمانان درست می‌شده است (لارسون، ۱۳۷۵). نام انگلیسی میخک Carnation می باشد. این نام گرفته شده از واژه لاتین Carnis می باشد که اشاره به رنگ صورتی کم رنگ بعضی ارقام آن دارد (Brickell, 1997). در یونان Dianthus به معانی گل خوشبخت^[۶] و گل خدایان می‌باشد. هم‌چنین عقیده براین است که نام Dianthus از واژه‌های یونانی Dios به معنای خدا و Anthus به معنای گل گرفته شده است )لارسون، ۱۳۷۵؛ Bunt and Marjorie, 1982).

۱-۳- انواع میخک

بانت و کاکشول (Bunt and Cockshull, 1985) میخک را بر اساس شکل ساقه گل‌دهنده آن دسته‌بندی کردند. در نوع استاندارد^[۷] ساقه گل‌دهنده منشعب نبوده و تنها یک گل انتهایی درشت در انتهای ساقه قرار دارد. در نوع دیگر گل‌های جانبی بیشتری تشکیل شده است که در پایان تولید یک ساقه منشعب گل‌دهنده می‌‌نماید. این دسته را مینیاتور^[۸] می‌نامند. رقم‌های ویژه‌ای برای تولید نوع مینیاتورگزینش شده‌اند، ولی این ارقام در مقایسه با نوع استاندارد استحکام ساقه کمتری داشته و گل‌های کمتری در زمستان تولید می‌کنند.
Carnations و Pinks نام‌های متداول باغبانی برای گونه‌های مختلف جنس Dianthus می‌باشند. از انواع Pinks می‌توان به Cottage، Rockery، Annual و Cluster-head اشاره کرد.
گونه‌های متداول Pink شامل Dianthus plumarius، D. alpinus، D. sylvestris،D. chinensis ، D. deltrorides، D. superbus، D. armeria و … می‌باشند. این‌ها از ^[۹]D. barbatus به وجود آمده اند و به آسانی بوسیله برگ‌های شمشیری شکل و گل‌های خوشه‌ای تشخیص داده می‌شوند.
Carnations نیز به چندین نوع دسته‌بندی می‌گردند که سه نوع آن یعنی
Annual carnation، Border carnation و Perpetual-flowering carnation بیشتر متداول هستند (Brickell, 1997). میخک زیر کشت با نام علمی Dianthus caryophyllus L. که به عنوان Wild carnation یا Clove pink شناخته می‌شود از اجداد Border carnations می‌باشد (Brickell, 1997).

١-۴- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخک

این گیاه متعلق به تیره میخک‌سانان^[۱۰] می‌باشد. این تیره شامل ٨٠ جنس و ٢٠٠٠ گونه است که روی کره زمین پراکنده‌اند (صانعی شریعت پناهی، ۱۳۷۲).
چندین گونه از میخک به عنوان گیاه زینتی برای تزیین باغ، گل بریدنی و یا به عنوان گل گلدانی کشت می‌شوند، اما بیشترین گونه‌ای که به صورت تجاری کشت می‌شود گونه caryophyllus می باشد (Bunt and Cockshull, 1985). این گیاه چند ساله تابستان گل می‌باشد اما انواع یکساله یا دو ساله آن‌ها نیز وجود دارد، که به دلیل تولید گل‌های فراوان زیاد کشت می‌شوند. قرنفل^[۱۱] که دو ساله است برای تزیین باغچه مناسب است (Brickell, 1997). گیاهان گونه caryophyllus علفی و دارای برگ‌های ساده و متقابل بوده که پهنک آن‌‌ها اغلب باریک است. گل‌آذین^[۱۲] آن گرزن دو سویه^[۱۳] است. گل ها دوجنسه^[۱۴] بوده و گرده‌افشانی آن ها توسط حشرات انجام می‌گیرد. اغلب گیاهان این تیره دارای گلبرگ می‌باشند ولی جام گل حقیقی نبوده و از تغییر شکل نافه گل به وجود آمده است (Brickell, 1997). کاسگل میخک از پنج کاسبرگ بهم پیوسته تشکیل شده و به شکل لوله کوچکی قاعده گلبرگ‌ها را می‌پوشاند. جام گل از پنج گلبرگ تشکیل یافته که لبه آن‌ها به سمت خارج برگشته و دندانه‌دار است. تعداد پرچم‌های آن ١٠ عدد می باشد. مادگی از دو برچه بهم پیوسته تشکیل شده و دارای تخمک‌های متعدد است. میوه پوشینه^[۱۵] است که از بالا شکاف خورده و بذر از آن بیرون می‌ریزد (صانعی شریعت پناهی، ۱۳۷۲ : وزوایی، ۱۳۷۵).
بلیک (Blake, 1962) گل کامل میخک را این گونه توصیف می‌کند: دارای دو جفت براکته که به یک کاسگل ۵ قسمتی متصل بوده و تشکیل یک فنجان ۵ دندانه‌ای می‌دهد. یک گل متوسط دارای ۶٠ گلبرگ (٢٠) و حداکثر ٣٠ پرچم می‌باشد و دارای یک تخمدان بزرگ ٢ تا ٣ برچه‌ای است.

١-۵- روش‌های افزایش میخک

افزایش این گیاه بیشتر به صورت رویشی و توسط قلمه‌گیری از ساقه‌های سبز آن صورت می‌گیرد. قلمه باید عاری از وجود بیماری‌ها، آفات و نماتد باشد. به همین منظور روش های پیشرفته‌ای در این زمینه به کار گرفته شده‌اند. کاشت بُرش نازکی از یک قلمه در محلول‌های مغذی برای تشخیص بیماری‌های آوندی و به کاربردن بلوک‌های هسته‌ای که کلیه گیاهان موجود در آن از طریق کاشت جوانه انتهایی تأمین می‌شود همگی جزیی از این روش ها می‌باشند (خلیقی،۱۳۸۰: Hartmann et al, 2002). افزایش از طریق بذر تنها در تولید ارقام جدید بکار می‌رود. D. barbatus و D. plumarius را به طور معمول با بذر می‌افزایند. هرچند که آن‌ها را می‌توان براحتی به روش قلمه در تابستان افزود، که در این صورت زودتر به گل می‌روند (Bunt and Cockshull, 1985). افزایش گونه‌های حاشیه‌ای^[۱۶] به روش افکندن در اواخر تابستان صورت می‌گیرد از فنون کشت بافت و ریزافزایی نیز می‌توان برای تولید انبوه و هم‌چنین قلمه‌های عاری از بیماری استفاده نمود. (Brickell, 1997).

۱-۶- اهمیت و اهداف پژوهش

میخک یکی از محبوب‌ترین، اقتصادی‌ترین و مهم‌ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی (Mii, 1994) و رقم‌های چند رنگ و منحصر به فرد است (Dole and wilkins, 2005؛ Burich et al, 1996). این گیاه یکی از محصولات با ارزش برای صنعت گل بریدنی بوده و تقاضا برای ارقام جدید و بهبود یافته آن رو به افزایش است. به هر حال، تراریختی ژنتیکی میخک به تازگی به دلیل کمبود یک تکنیک معمول کارا محدود شده است. محدودیت‌های موجود در روش‌های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی‌های هتروزیگوسیتی^[۱۷] بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای- مولکولی برای بهبود ویژگی‌های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. کاربردی شدن فنون مولکولی خود نیازمند گسترش روش‌های مختلف کشت بافت^[۱۸] است. به طور معمول یک یا چند ویروس، باکتری و یا قارچ قلمه‌های ساقه این گیاه را آلوده می‌کنند (لارسون، ۱۳۷۵). همچنین از دیگر مشکلات میخک می توان به از بین رفتن تعداد زیادی از قلمه های این گیاه در حین افزایش اشاره کرد. برخی از روش‌های کشت بافت و ریز افزایی^[۱۹] می‌توانند مشکلات ناشی از ویروس، باکتری و سایر عوامل بیماری‌زا را برطرف ساخته و در تولید انبوه گیاهان یک شکل، عاری از بیماری و مناسب صدور به کشورهای اطراف به ما کمک ‌نمایند. همچنین از کشت بافت می‌توان به عنوان ابزاری برای انتقال ژن استفاده نمود و ویژگی‌های مطلوبی را گزینش و به گیاه منتقل کرد. در محصولات گلکاری انتقال ژن های گزارشگر مانند GUS با بهره گرفتن از Agrobacterium tumefaciens در داوودی، میخک(Lu et al, 1991) و ورد (Firoozabady et al, 1991) به دست آمده است. این بررسی ها ممکن است مدل های مفیدی زمانی که ژن های مطلوب به جای ژن های گزارشگر یا نشانگر گزینشگر به درون گیاهان هدف انتقال می یابند، ارائه دهد (Stachel et al, 1986). این پژوهش به منظور انجام کشت بافت دو رقم استاندارد و مینیاتور میخک و ارزیابی شرایط بهینه انتقال ژن با بهره گرفتن از tumefaciens Agrobacterium به آن ها صورت گرفته است.
فصل دوم

۲- مروری بر پژوهش های پیشین

۲-۱- ریزافزایی و کشت بافت میخک

۲-۱-۱- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن

اولین گام در هر برنامه کشت بافت موفق، گزینش یک منبع ریزنمونه مناسب و به دنبال آن تعیین بهترین تیمار گندزدایی است. به صورت فراگیر هر بافت یا اندام گیاهی را می توان به عنوان ریزنمونه به کار گرفت، اما درجه موفقیت به سیستم کشت به کار رفته، گونه کشت شده و حذف آلوده گرهای سطحی از ریزنمونه بستگی دارد. صالحی (ُSalehi, 2006)، تیمار گندزدایی سطحی مناسب برای ریزنمونه های نوک شاخساره میخک را چنین گزارش کرد: ریزنمونه ها پس از شستشوی ابتدایی به مدت ۱۰ دقیقه در محلول شوینده (ریکا) قرار گرفته، سپس به مدت ۱ ساعت در زیر آب جاری قرار داده شده و سپس به مدت ۵/۰ یا ۱ دقیقه در اتانول ۷۰% و به دنبال آن ۱۵ دقیقه در کلراکس ۱۰% گندزدایی شدند. دلجو و همکاران (Delju et al., 2006)، تیمار گندزدایی جهت جوانه های گل نابالغ ۴ رقم میخک را شامل گندزدایی سطحی با اتانول ۷۰% به مدت ۳۰ ثانیه و استفاده از ماده شوینده تجاری ۲% به مدت ۲۰ دقیقه و در پایان ۳ بار آبکشی با آب مقطر گندزدایی شده را مناسب تشخیص دادند. نانتاسواتسری و همکاران (Nontaswatsri et al ۲۰۰۲) شاخساره های ۵ رقم میخک به طول ۵ تا ۸ سانتی متر را از گیاهان مادری رشد یافته در گلخانه جدا نموده و به مدت ۱۵ دقیقه در محلول کلراکس ۱۰% همراه با یک قطره Tween-20 قرار دادند، سپس ۲ بار و هر بار ۱۰ دقیقه در آب گندزدایی شده آبکشی گردیدند. آلتورست و همکاران (Altworst et al. 1994) از ریزنمونه های برگ به عنوان مواد شروع کننده برای باززایی گیاه استفاده کردند. در پژوهشی از بذرهای رقم ’Chabaud‘ میخک و رقم ’Tall Double Mix‘ قرنفل به عنوان ریزنمونه استفاده شد. بذرها نخست به مدت ۳ تا ۴ دقیقه در محلول کلرید نقره ۱/۰% گندزدایی سطحی شده و سپس ۳ مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشی شدند (Pareek and Kothari, 2003).
واتاد و همکاران (Watad et al. 1996) ریزنمونه های ساقه میخک را پس از گندزدایی سطحی به مدت ۱۵ دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم ۲% حاوی ۰۱/۰% Tween-20 و به دنبال آن ۳ بار آبکشی هر بار به مدت ۲ دقیقه با آب گندزدایی شده به کار بردند. مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) از برگ و قطعات پایه ای گل و گلبرگ^[۲۰] به عنوان ریزنمونه استفاده کردند. مسن ترین برگ ها دور ریخته شده و جوانه های گل و قلمه ها در محلول شوینده تجاری حاوی هیپوکلریت سدیم ۵% به مدت ۲۰ دقیقه گندزدایی سطحی شده و به دنبال آن ۳ مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشی گردیدند. آن ها بیان داشتند که گلبرگ های نابالغ و قطعات پایه ای گل ظرفیت ریخت زایی بالایی دارند.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) از برگ و گلبرگ گیاهان کشت بافتی به عنوان منبع ریزنمونه برای تشکیل شاخساره نابجا^[۲۱] استفاده کردند. آن ها نتوانستند رابطه ای بین ظرفیت باززایی برگ ها و گلبرگ های ارقام مختلف پیدا کنند. باززایی از ریزنمونه های برگ بیشتر موفق بود و شاخساره ها در مدت کمتری از ریزنمونه های برگ نسبت به گلبرگ باززایی شدند.
کانتیا و کوساری (Kantia and Kothari, 2002) بیان داشتند که نوع ریزنمونه استفاده شده برای افزونگری همگروهی^[۲۲] احتمال تغییرات ژنتیکی را تحت تأثیر قرار می دهد. ریزنمونه های برگ مواد مناسبی برای تشکیل شاخساره نابجا و آزمایشات انتقال ژن توسط اگروباکتریوم می باشند. آن ها همچنین بیان داشتند موقعیت (مکان) برگ ها روی گیاه در باززایی بعدی مهم می باشد و جوان ترین برگ ها تنها زیر مریستم انتهایی بهترین باززایی را نشان دادند.

۲-۱-۲- ریخت زایی و باززایی

باززایی گیاه، با کشت قطعه ای از بافت گیاهی عاری از بافت مریستمی از پیش تشکیل شده (منشأ نابجا^[۲۳])، یا از کشت یاخته ای و بافت پینه امکان پذیر است. باززایی گیاه به روش پرآوری جوانه جانبی^[۲۴] بر مبنای وجود بافت مریستمی از پیش تشکیل شده می باشد. در مقابل، باززایی نابجا از مکان های غیرمعمول از یک بافت کشت شده مانند سطح برگ، لپه، میانگره، دمبرگ و … که بافت مریستمی به طور طبیعی در این مناطق وجود ندارد، صورت می پذیرد (Chawla, 2000). آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1995) نشان دادند که باززایی تنها در ناحیه انتقالی^[۲۵] از ساقه به برگ یعنی پایه برگ امکان پذیر است. آن ها همچنین بیان داشتند که موقعیت یا مکان برگ روی گیاه برای باززایی بعدی دارای اهمیت است و جوان ترین برگ ها بیشترین توانایی باززایی را دارند. نانتا سواتسری و فوکای (Nontaswatsri and Fukai, 2005) نشان دادند که ریزنمونه های گره ای پتانسیل بیشتری برای تولید شاخساره نسبت به ریزنمونه های برگ دارند.
امیرعلی و همکاران (Amirali et al, 2008) پیشنهاد کردند که کاربرد مریستم انتهایی در مقایسه با مریستم گره ای برای پرآوری شاخساره مناسب تر است. آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992)، جوان ترین برگ های گسترش یافته زیر مریستم انتهایی را مناسب ترین ریزنمونه برای باززایی تشخیص دادند.
مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) نشان دادند که باززایی شاخساره تنها در نواحی پایه ای قطعه های گلبرگ امکان پذیر می باشد. فیشر و همکاران (Fisher et al. 1992) اثبات نمودند که شرایط کاشت بیش از ظرفیت ریخت زایی^[۲۶] قسمت های مختلف گلبرگ برای باززایی شاخساره اهمیت دارند.

۲-۱-۳- رویان زایی بدنی^[۲۷]

رویان زایی بدنی عبارتست از تشکیل رویان از یاخته های بدنی^[۲۸] در شرایط درون شیشه ای به طوری که این رویان ها شبیه به رویان معمولی درون بذر می باشند و قادرند به صورت گیاه کامل نمو پیدا کنند. از این روش کشت بافت می توان به صورت ابزاری برای بررسی های پایه نظیر بیوشیمی، فیزیولوژی، مورفولوژی و تشریح که در بسیاری از دستاوردهای فناوری زیستی مانند انتقال ژن، حفظ ژرم پلاسم، تولید بذر مصنوعی، تولید متابولیت های ثانویه، ایجاد گوناگونی ژنتیکی و حذف ویروس از گیاه استفاده نمود (Chawla, 2000). گزارش های بسیاری نشان داده اند که گیاه میخک از راه تشکیل شاخساره نابجا روی ریزنمونه های مختلف مانند ساقه، برگ، گلبرگ، نهنج، تخمدان و تخمک باززایی شده است (Edtington et al. 1984)، در حالی که گزارش های اندکی در مورد باززایی این گیاه از راه رویان زایی بدنی انتشار یافته است (Fery et al, 1992،,۱۹۹۸ Vicient and Martinez). برخی اوقات رویان های بدنی نسبت به دیگر روش های افزایش رویشی مطلوب تر می باشند که به سبب احتمال تنظیم افزایش با بهره گرفتن از بیوراکتورها می باشد (Vicient and Martinez, 1998).
بیشتر رویان های بدنی یا کشت های رویانی می توانند در دمای ۱۹۶- درجه سلسیوس نگهداری شوند (Von Arnold et al., 2002) که این روش امکان ایجاد بانک های ژنی را فراهم می سازد. افزون بر این، رویان زایی بدنی شرطی مهم برای شماری از ابزارهای فناوری زیستی برای بهبود ژنتیکی می باشد (Sankhla et al, 1995). همچنین رویان های بدنی نقشی کلیدی در روش های انتقال ژن بازی می کنند (Yantcheva et al, 1995.).
فری و همکاران (Fery et al, 1992) ایجاد رویان بدنی از پینه های حاصل از ریزنمونه های ساقه گیاه میخک را گزارش کردند. در این پژوهش ویژگی های ریخت شناسی و تشریحی پینه های غیر رویان زا و پینه های رویان زا به دست آمده از ریزنمونه های گلبرگ و رویان های بدنی گیاه میخک شرح داده شده است. دلجو و همکاران (Deljou, 2006)، اثر غلظت های مختلف سوکروز بر رویان زایی بدنی ۴ رقم میخک را مورد بررسی قرار دادند. در پژوهش ایشان از ریزنمونه های گلبرگ ارقام میخک استفاده شد. در این پژوهش مشخص شد که با افزایش غلظت سوکروز در محیط کشت، رویان زایی بدنی گسترش می یابد. بیشترین میزان پینه های رویان زا، از محیط کشت دارای ۹ و ۱۲ درصد سوکروز به دست آمد، در حالی که در غلظت های بالاتر از ۱۵ و ۱۸ درصد کاهش یافت. نتایج این پژوهش نشان داد که غلظت های بالاتر سوکروز بلوغ رویان های بدنی را بهبود می بخشد.
از جمله عوامل مؤثر بر انگیزش رویان های بدنی و نمو بعدی گیاه می توان به موارد زیر اشاره کرد:

۲-۱-۳-۱- تنظیم کننده های رشد

افزودن تنظیم کننده های رشد به ویژه اکسین و یا اکسین به همراه سیتوکینین برای شروع رشد و انگیزش رویان زایی ضروری است (Feher et al, 2003). به هر حال، نمو رویان در رویان های بدنی در نبود تنظیم کننده های رشد نیز گزارش شده است (Choi et al, 1998). انگیزاننده های غیر هورمونی همچنین برای افزایش رویان زایی بدنی استفاده می شوند. برخی از این انگیزاننده ها شامل غلظت های بالای سوکروز یا تنش اسمزی (Kamada et al, 1993)، یون های فلزات سنگین (Pasternak et al, 2002) و دمای بالا (Kamada et al, 1989) می باشد. دلجو و همکاران (Deljou, 2006) اثر مانیتول بر رشد رویان های بدنی تولید شده از پینه رویان زای میخک را بررسی کردند. آن ها بیان داشتند که در محیط کشت حاوی مانیتول بدون سوکروز رویان بدنی ایجاد نشد. اگر چه نقش دقیق مانیتول روی افزایش تعداد رویان ها از پینه های رویان زای میخک مشخص نیست اما با توجه به این که وجود سوکروز در محیط حاوی مانیتول برای رویان زایی ضروری است می توان نتیجه گرفت که اثر مانیتول روی افزایش تعداد رویان ها به عنوان منبع تأمین کربن مؤثر نبوده، بلکه به احتمال با تغییرات پتانسیل اسمزی ناشی از حضور مانیتول در ارتباط است. اثر ۲,۴-D و پس از آن NAA بر رویان زایی بدنی بیش از دیگر اکسین ها می باشد. آن ها در تسریع بلوغ رویان، به ویژه در رشد لپه ها مؤثر هستند. در برخی مواقع سیتوکینین ها برای رشد رویان و تبدیل آن به گیاهچه لازمند (Tanaka et al, 2000).
به هر حال، در داوودی^[۲۹] کاینتین در ترکیب با یک اکسین به ویژه IAA برای تحریک رویان زایی بدنی گزارش شده است (Tanaka et al, 2000). تیدیازورون به تنهایی یا در ترکیب با دیگر تنظیم کننده های رشد برای تحریک رویان زایی بدنی در تعدادی از گونه های گیاهی گزارش شده است (Zhang et al, 2005).
اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) باززایی گیاه از راه اندام زایی مستقیم^[۳۰] و رویان زایی بدنی دو رقم میخک مینیاتور را مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش محیط موراشیگی و اسکوگ (MS)( Murashige and Skoog, 1962) جامد حاوی BAP و NAA برای انگیزش مستقیم شاخساره های نابجا استفاده شد. محیط کشت مناسب برای باززایی هر دو رقم شامل محیط MS حاوی ۹/۰ میلی گرم در لیتر BAP و ۹/۰ میلی گرم در لیتر NAA بوده است. در این پژوهش وجود ۲,۴-D در ترکیب با BAP و کازیین هیدرولیزشده به طور موفقیت آمیزی در انگیزش پینه رویان زا مؤثر واقع شد.

۲-۱-۳-۲- محیط پینه زایی

پینه یک بافت گیاهی کم و بیش سازمان نیافته است که در زخم های بافت ها و اندام های تمایز یافته، به وجود می آید. بنابراین پینه یک بافت سازمان نیافته با تمایز خیلی پایین است (Chawla, 2000). تشکیل پینه زیر تأثیر مواد تنظیم کننده رشد برون زا که به محیط کشت افزوده می شوند، قرار می گیرد. نوع ماده تنظیم کننده رشد مورد نیاز و غلظت مصرفی آن در محیط کشت به شدت به نژادگان و محتوای هورمونی درون ریزنمونه بستگی دارد (Chawla, 2000). در پژوهشی روی میخک تشکیل پینه روی محیط کشت MS دارای ۳۰ گرم در لیتر سوکروز، ۲ میلی گرم در لیتر۲,۴-D و ۲/۰ میلی گرم در لیتر BA حاصل شد (Karami and Kordestani, 2007 ).
آرچنا و کوتاری (Archana and Kothari, 2002) در بررسی برای تشکیل جوانه های شاخساره نابجا همراه با تشکیل پینه، از ریزنمونه های برگ میخک کشت شده روی محیط کشت MS حاوی ۵/۰ میلی گرم در لیتر BAP و ۱ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D استفاده کردند.
در پژوهش های بسیاری (Altvorst et al, 1996) اثر قسمت انتهای نزد پاهنگ^[۳۱] برگ در باززایی تایید شده است. اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) پیشنهاد کردند که محیط کشت مناسب برای انگیزش پینه شامل MS جامد دارای ۱ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D، ۲/۰ میلی گرم در لیتر BAP، ۳% سوکروز و ۸ گرم آگار می باشد.

۲-۱-۳-۳- محیط ریشه زایی

محیط ریشه زایی استفاده شده برای ارقام میخک به شدت وابسته به نژادگان بوده و نمی توان محیطی عمومی برای ریشه زایی همه ارقام پیشنهاد نمود (Messeguer et al, 1993؛ Salehi 2005). میروشنچنکو و دولگوو (Miroshnichenko and Dolgov, 2000) محیط MS نیم غلظت دارای ۷% آگار و ۱۰ گرم در لیتر سوکروز را مناسب ریشه زایی ریزنمونه های برگ و گلبرگ گندزدایی شده رقم ۱۲’Dia ‘ تشخیص دادند. آرچنا و کوتاری (Archana and Kothari, 2002) برای تشکیل ریشه از ریزنمونه های برگD. chinensis L. محیط MS نیم غلظت دارای ۵/۰ میلی گرم در لیتر IAA را پیشنهاد نمودند. بهترین محیط ریشه زایی با بهره گرفتن از شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های مریستم انتهایی و مریستم تک گره شامل محیط MS با ۱ میلی گرم در لیتر NAA تشخیص داده شد. در پژوهشی توسط اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) تشکیل گیاهان با پدیدگان معمولی و ریشه دهی آسان روی محیط MS حاوی ۰۵/۰ میلی گرم در لیتر BAP و ۲۵۰ میلی گرم در لیتر کازیین هیدرولیز شده به دست آمد.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) محیط مناسب برای انگیزش ریشه در شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های برگ میخک انواع ’Sim‘، ’ Mediterrenean ‘، ’ ‘Spray و ’Diantini ‘را محیط MS محتوی ۱/۰ میلی گرم در لیتر NAA گزارش نمودند. در بررسی بهترین محیط ریشه زایی برای شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های برگ گونه های میخک، محیط MS همراه با ۱ میلی گرم در لیتر NAA گزارش شد.
صالحی (Salehi 2005) بیان داشت که ممکن است بتوان یک محیط عمومی برای پرآوری شاخساره ارقام میخک ارائه نمود، اما برای ریشه زایی بیان چنین روش کاری امکان پذیر نیست. بر این اساس در این پژوهش بهترین محیط برای ریشه زایی ارقام مختلف میخک محیط MS با تنظیم کننده های رشد IBA و NAA در غلظت های مختلف عنوان شد. به صورت فراگیر، شاخساره های پرآوری شده در محیط کشت برای ریشه زایی به محیط محتوی اکسین انتقال داده می شوند. به خوبی مشخص شده است که برای انگیزش ریشه های جدید به میزان کمی سیتوکینین در مقایسه با مقدار زیاد اکسین نیاز است (Chawla, 2000).

۲-۱-۳-۴- سن مواد گیاهی و شرایط کاشت