چربی نمونه نیز با بهره گرفتن از سوکسله و به کمک اتر از جیره غذایی استخراج میشود. برای این کار میزان ۲ تا ۳ گرم نمونه غذا را در یک کارتوش قرار داده و دهانه آن را با مقداری پشم شیشه به صورت شل میپوشانیم. کارتوش را در استخراج کننده قرار داده و آنقدر پترولیوم اتر اضافه میکنیم تا یک بار سیفون گردد. مقدار دیگری پترولیوم اتر افزوده تا نیمی از محفظه استخراج پر گردد. مبرد را در ادامه وصل نموده و مجموعه را بر روی هیتر برقی قرار میدهیم تا به آرامی جوش آمده. مجموعه در این شرایط حداقل برای ۱۰ بار باقی میماند تا پر و خالی گردند. سپس میزان چربی با کمک فرمول زیر محاسبه میگردد:

که در آن:
W₁ برابر است با وزن بالن خالی (برحسب گرم)
W₂ برابر است با وزن بالن بعلاوه چربی (برحسب گرم)
W₃ برابر است با وزن نمونه غذایی مورد آزمایش (برحسب گرم)
این پروژه در یک مزرعه محلی پرورش ماهیان سردآبی واقع در منطقه شاهرود استان سمنان انجام میشود. تعداد۵۰۰ عدد بچه ماهی قزل آلا از ن‍ژاد فرانسوی (Aqualand) برای این منظور تهیه و پس از سازگاری به محیط مزرعه (برای ۲ روز) با بهره گرفتن از غذای پایه (تیمار شاهد) در سه نوبت به مدت چهار روز تا حد سیری غذادهی خواهند شد. نمونه ها پس از شروع غذادهی و همزمان با شروع روز چهارم، زیستسنجی میگردند. ماهیان برای این منظور ابتدا توسط اسانس گل میخک به میزان ppm 250 (سلطانی، ۱۳۸۰) بیهوش و میزان طول و وزن آنها توسط یک خطکش با دقت ۱ میلی متر و ترازوی دیجیتال با دقت ۰۱/۰ گرم اندازه گیری میگردد. مدت زمان انجام آزمایش به مدت ۸ هفته میباشد.
ماهیان در ادامه به صورت کاملاً تصادفی از محیط اصلی ذخیرهسازی ماهیان توسط یک ساچوک برداشته شده و در تیمارهای پنج گانه با سه تکرار قرار خواهندگرفت. تعداد ۳۰ عدد ماهی ۱۵گرمی در هر یک از تیمارها قرار خواهند گرفت که در پایان آزمایش از تیمارهای آزمایشی خارج و متغییرهای مورد بررسی آنها، تعیین خواهند شد.
ب- متغیرهای مورد بررسی در قالب یک مدل مفهومی و شرح چگونگی بررسی و اندازه گیری متغیرها:
فاکتورهایی نظیر درجه حرارت، اکسیژن محلول، pH در این آزمایش به عنوان متغیرهای شاهد هر دو هفته مورد بررسی میگردند. اندازه گیری این فاکتورها با کمک یک دستگاه پرتابل مولتیمتر با مدل TPS100 ساخت کشور استرالیا صورت میگیرد. این تحقیق همچنین به مطالعه متغیرهای موثر در رابطه با تاثیر روی شامل میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، سوپراکسید دیسموتاز، گلوتانین پروکسیداز، مالون دی‏آلدئید، گلوتاتیون پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون S-ترانسفراز فاکتورهای خونی، میزان روی در سرم خون، استخوان، کبد و همچنین آنالیز لاشه خواهد پرداخت.
آنالیز لاشه
تعداد ۳ قطعه ماهی برای آنالیز لاشه و تعیین ترکیبات بدن به صورت تصادفی از هر تکرار در انتهای آزمایش انتخاب و یک لایه نازک از فیله آنها پس از خشک کردن آب سطحی در کف ظروف پتریدیش قرار داده میشود. این فیله در ادامه برای مدت ۲۴ ساعت در آون با دمای ۶۰ درجه سانتیگراد خشک و توسط مخلوطکن صنعتی به صورت پودر در میآیند. نمونه ها تا زمان استخراج چربی و پروتئین در ظروف دربسته درون فریزر با دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری خواهند شد. درصد رطوبت بدن با قرارگیری ۵/۰ گرم از هر نمونه در دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت تعیین میگردد. درصد رطوبت نمونه های خشک پس از توزین مجدد و محاسبه اختلاف وزن تر و خشک به صورت درصد محاسبه میشود (AOAC, 1990).
میزان پروتیئن نیز با اندازه گیری نیتروژن (N×۶.۲۵) طبق روش کجلدال (که پیشتر توضیح داده شده است) تعیین میشود. چربی از طریق روش سوکسله با اتر طبق روش مذکور استخراج میشود. میزان خاکستر نیز با قرار دادن نمونه ها در کوره الکتریکی با دمای ۵۵۰ درجهسانتیگراد به مدت چهار ساعت اندازه گیری میشود (AOAC, 1995).
میزان منیزیم در سرم خون
نمونه خون برای این منظور از ورید ساقه دمی تهیه شده و در میکروتیوپ قرار داده میشود. نمونه پس از انتقال به آزمایشگاه در سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۱۰دقیقه سانتریفیوژ شده و سرم خون از آن جدا میشود. سرم در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد تا زمان تعیین میزان روی نگهداری میشود. سرم خون در ادامه با آب دیونیزه به نسبت ۱ به ۲ رقیق (ژانگ و همکاران، ۲۰۰۷) و میزان روی با کمک دستگاه جذب اتمی در طول موج ۲۱۳.۹ نانومتر تعیین میشود (انیانوا و همکاران، ۲۰۰۱).
میزان منیزیم در استخوان
استخوان به این منظور و برای تسهیل جداسازی بافت همبند به مدت ۲۰ دقبقه در دمای ۱۲۰ درجه سانتیگراد اتوکلاو شده و سپس برای ۲۴ ساعت در دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد خشک میگردد. استخوانها در ادامه برای سه مرتبه طی فواصل ۲۴ ساعته در پترولیوم اتر (petroleum ether) قرار میگیرد تا فرایند چربیزدایی به صورت کامل انجام پذیرد. استخوانهای فاقد چربی را خشک و در دمای ۵۰۰ درجه سانتیگراد درون کوره با حرارت غیرمستقیم^[۱] طی ۲۴ ساعت به خاکستر تبدیل میشوند. نمونه پس از آن در ۵ میلی لیتر اسید کلریدریک ۱ نرمال حل و تا حد امکان با آب دیونیزه رقیق میگردند. میزان جذب اتمی توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر طبق روش توضیح داده شده در بالا تعیین میگردد (ساتوه و همکاران، ۱۹۹۰).
میزان منیزیم در کبد
حدود ۲ گرم از بافت کبد برای این منظور از یک مکان بریده شده و تا زمان استفاده در پروپیلن در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری میشوند. نمونه به صورت مرطوب در مخلوطی از اسید نیتریک و اسید پرکلریک (به نسبت ۱ به ۵) هضم شده و با آب دیونیزه رقیق میشود. میزان روی توسط دستگاه اسپکتوفتومترطبق روش فوق تعیین میشود (هیل و همکاران، ۱۹۸۳).
بررسی فاکتورهای خونی
نمونه های ماهی جهت بررسی فاکتورهای خونی توسط اسانس گل میخک به میزان ۲۵۰ ppm (سلطانی، ۱۳۸۰) بیهوش و میزان ۱ میلیلیتر از خون آنها با قطع ساقه دمی درون لولههای حاوی یک قطره هپارین ریخته میشود (اسوبودوا و همکاران، ۱۹۹۱). سپس تعداد گلبولهای قرمز، غلظت هموگلوبین و درصد هماتوکریت هر نمونه تعیین خواهد شد. شمارش گلبولهای قرمز و سفید توسط لام نئوبار انجام میگیرد. روش کار به این صورت خواهد بود که مجموع گلبولهای موجود در ۵ خانه از دو قسمت لام با هم جمع و میانگین اعداد در ۱۰۰۰۰ ضرب میگردد تا تعداد گلبولها بر حسب عدد بر میلیمتر مکعب به دست آید. میزان هماتوکریت نیز از طریق سانتریفیوژ لولههای مویین حاوی خون به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه تعیین میگردد. شناسایی گلبولهای سفید و تعیین درصد هر گروه از آنها نیز با تهیه گسترش خونی و رنگآمیزی به روش گیمسا انجام میگیرد. تعداد ۱۰۰ عدد گلبول سفید از هر نمونه در ادامه پس از خشک شدن در دمای اتاق زیر میکروسکوپ شناسایی و نسبت هر یک از انواع گلبولهای سفیبد شامل لنفوسیت، منوسیت، نوتروفیل، ائوزینوفیل و بازوفیل به صورت درصد تعیین میگردد.
فاکتورهای رشد و تجزیه ترکیبات لاشه
شاخص رشد و کارایی تغذیه شامل میزان خوراک مصرفی (FI)، افزایش وزن (WG)، نرخ رشد ویژه (SGR)، شاخص وضعیت (CF)، ضریب تبدیل غذایی (FCR)، نسبت بازده پروتئین (PER)، درصد بقاء (SR)، شاخص کبدی (HSI) نیز در فواصل دو هفتهای طبق فرمولهای زیر محاسبه خواهند شد.