• ۱۰۰ تا ۱۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت LB جامد حاوی آنتی بیوتیک های مناسب (آمپی سیلین، تتراسایکلین یا زئوسین) کشت داده شد و پلیت ها به مدت ۱۶ ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شدند.

 

• پس از گذشت این مدت، از کلنی های تشکیل شده بر روی محیط کشت جامد، ماتریکس سلولی تهیه گردید.

 

۲-۶-۶ بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع

 

• مقدار µl50 از محلول EDTA(10 میلی مولار) به تیوبها اضافه کرده و حدود ۷۰% از ماتریکس باکتریایی را در آن حل نموده و سوسپانسیون را ورتکس نمودیم.

 

• مقدارµl 50 از محلول NSS (پیوست ۴) را به هر تیوب افزوده و به مدت ۳۰ ثانیه ورتکس نمودیم.

 

• تیوب ها را به مدت ۵ دقیقه در حمام آبی°C 70 گرماگذاری نمودیم.

 

• مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تیوب ها اضافه کرده و هر تیوب به مدت ۳۰ ثانیه ورتکس گردیده و سپس به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.

 

• محتویات هر سلول در دمای ۴ درجه به مدت ۳ دقیقه در g3000 سانتریفوژ گردید.

 

• مایع رویی هر تیوب به تیوب جدید منتقل شد و میزان µl25 از آن بر روی ژل آگارز ۱% برده شد.

 

۲-۶-۷ PCR بر روی کلنی های باکتریایی/ مخمری
با رعایت شرایط استریل، از کلنی های رشد یافته بر روی پلیت ماتریکس، مقداری باکتری برداشته و در مقداری آب دیونیزه استریل حل نموده و به مدت ۵ دقیقه در بن ماری در حال جوش (۱۰۰ درجه سانتی گراد) جوشانده و سپس از این محلول بعنوان الگوی DNA برای انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده می شود.

۲-۶-۸ استخراج پلاسمید در مقیاس کم

 

• باکتری E. coli حاوی پلاسمید مورد نظر را به لوله ml5 محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک مناسب تلقیح کرده و به مدت ۱۶ ساعت (ON) درون شیکر انکوباتور در دمای C°۳۷ با دور ۱۴۰ rpm قرار می دهیم.

 

• سلولهای باکتریایی را با سرعت rpm10000 به مدت ۳ دقیقه جمع آوری می نماییم.

 

• در این مرحله رسوب باکتریایی را می توان در دمای °C20- نگهداری نمود.

 

• رسوب حاصله از مرحله ۳ را در µl100 از محلول شماره ۱ (پیوست ۵) حل می کنیم.

 

• µl200 از محلول شماره ۲ (پیوست ۵) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه درون یخ قرار می دهیم.

 

• µl150 استات سدیم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه درون ظرف یخ نگهداری می نماییم.

 

• محلول فوق را در rpm12000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ می نماییم.

 

• با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.

 

• هم حجم مایع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به نسبت ۲۵، ۲۴، ۱ اضافه می کنیم.

 

• محلول را در rpm12000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ می نماییم.

 

• با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.

 

• به میزان ml1 اتانول ۹۶% سرد به مایع رویی اضافه کرده و به مدت ۱۶ ساعت (ON) در °C20- نگهداری می نماییم.

 

• نمونه را در rpm12000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ می نماییم.

 

• به میزان µl750 اتانول ۷۰% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتریفوژ می نماییم.

 

• رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب دیونیزه استریل حل می نماییم.

 

۲-۶-۹ استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد
برای این کار از روش لیز قلیایی استفاده شد. مراحل انجام این روش به شرح زیر می باشد:

 

• میزان µl450 از محلول آنتی بیوتیکی تتراسایکلین (غلظت نهاییml / µg15) را به ml300 محیط کشت مایع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F’ حاوی پلاسمید مورد نظر را به این محیط تلقیح کرده و به مدت ۱۶ ساعت (ON) بر روی شیکر انکوباتور C°۳۷ قرار می دهیم.

 

• محیط کشت به لوله های ۵۰ میلی لیتری منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت ۴ دقیقه سانتریفوژ می گردد.

 

• پس از انجام سانتریفوژ، محیط کشت رویی تخلیه شده و رسوب سلولی جمع آوری می گردد. در این مرحله می توان رسوب سلولی را در دمای °C 20- نگهداری نمود.

 

• رسوب حاصل از مرحله ۳ را در ml6 از محلول شماره ۱ (پیوست ۵) حل می کنیم.

 

• به مقدار ml12 از محلول شماره ۲ (پیوست ۵) به تیوب فوق اضافه نموده و ۱۰ دقیقه درون یخ قرار می دهیم.

 

• سی میلی لیتر از محلول استات سدیم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت ۳۰ دقیقه درون یخ نگهداری می نماییم.

 

• محلول را به مدت ۱۵ دقیقه در rpm12000 در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ می نماییم.

 

• مایع رویی را از گاز استریل عبور داده و به محلول فیلتر شده، ml16 ایزوپروپانول اضافه نموده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق نگهداری می کنیم. سپس این محلول را در دمای ۴ درجه به مدت ۱۰ دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ نموده، مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک می کنیم.

 

• رسوب خشک شده را در ml1 آب دیونیزه استریل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت ۱ ساعت در دمای °C37 گرماگذاری می نماییم.

 

• به محلول فوق به نسبت ۱:۱ از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت ۱۰ دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ می نماییم.

 

• فاز رویی (فاز آبی) را به تیوپ جدید منتقل کرده و دو برابر حجم این فاز، به آن اتانول ۹۶% سرد اضافه نموده و به مدت ۱۶ ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در rpm12000 سانتریفوژمی نماییم.

 

• مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول ۷۰% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتریفوژ می نماییم.

 

• مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب دیونیزه حل می کنیم.