۲-۲-۱۸-۳- اسمو پرایمینگ ^[۷۸] ( پیش تیمار اسمزی)
یکی ازپرکاربردترین انواع پرایمینگ، اسمو­پرایمینگ می­باشد. اسمو­پرایمینگ با بهره گرفتن از محلول­هایی با پتانسیل اسمزی اندک به کار برده می­شوند[۹۱].
در تیمار اسمو­پرایمینگ از مواردی همچون مانیتول و پلی­اتیلن گلایکول، KNO₃، KH₂PO₄ و غیره استفاده می شود.
در پلی­اتیلن گلایکول معمولا به علت خاصیت خنثی بودن در فعالیت­های بیوشیمیایی و نیز به دلیل ماهیت غیر سمی آن بیشترین کاربرد را در این زمینه دارد[۵۵].
۲-۲-۱۸-۴- هالو پرایمینگ^[۷۹] ( پیش تیمار نمکی)
در این روش بذور در محلول­های نمکی همچون NaCl، ،CaCl₂ و(NO₃) Caبا غلظت­های مختلف خیسانده می­شوند[۸۳].
وظیفه­ی نهایی بذر زنده، جوانه زدن و به دنبال آن رشد جنین و تبدیل آن به یک گیاه بالغ است. شرایط شیمیایی که در محیط پیرامون یک بذر فراهم است، می ­تواند عامل تعیین­کننده در جلوگیری یا تحریک جوانه زدن باشد، ترکیبات شیمیایی که به درون رویان نفوذ و فعالیت متابولیکی را تحریک می­ کنند، اغلب در القای جوانه زنی مؤثر هستند[۵].
۲-۲-۱۸-۵- هورمونال پرایمینگ^[۸۰] ( پیش تیمار هورمونی)
در این روش نیز از از هورمون­های گیاهی مانند اسید جیبرلیک، اسید آبسزیک، اسید جاسمونیک، و تنظیم کننده ­ای رشد مانند سایکوسل و کینتین و. . . استفاده می شود[۵].
استفاده از از تنظیم کننده­ های رشد به عنوان یک روش در تغییر فیزیولوژی گیاهان زراعی، همراه با سایر روش ها، ضروری به نظر می­رسد، زیرا در مقایسه با طولانی بودن مدت زمان اصلاح ژنتیکی گیاهان و دستکاری در ساختار ژنتیکی آن ها، نتایج کاربرد تنظیم کننده­ های رشد سریع­تر می­باشد[۵].
۲-۲-۱۸-۶-ماتریک پرایمینگ^[۸۱] ( پیش تیمار جامد ماتریکی)
در این روش بذرها با موادی که دارای سطح تماس زیاد و اندازه ذرات مختلف و به حالت جامد غیر قابل حل با فعالیت شیمیایی کم است مخلوط می­شوند. این مواد جاذبه­الرطوبه و شامل موادی مانند ورمیکولات^[۸۲]، زئونولیت^[۸۳]، سیلت^[۸۴]، میکروسل^[۸۵]، هستند که دارای پتانسیل ماتریکی بالا و پتانسیل اسمزی پایین می­باشند[۱۲۳].
۲-۲-۱۸-۷- پیش تیمار بخار^[۸۶]
در این روش بذرها به طور مستقیم درون محلول قرار نمی­گیرند، بلکه رطوبت به حالت بخار به بذرها داده می شود و بذرها در داخل گردون­های مرتباً در حال چرخش می­باشد، تا بخار به طور کامل به تمامی بذرها برسد[۱۶۵].
۲-۲-۱۸-۸- عوامل موثر در پرایمینگ (پیش تیمار بذر)
صرف نظر از نوع پرایمینگ عوامل چندی بر نتایج حاصل از این روش تأثیر می­ گذارد، که شامل موارد زیر می باشد:
۲-۲-۱۸-۸-۱- دما
به نظر می رسد دما بر نتایج حاصل از پرایمینگ تأثیر می­ گذارد[۱۵۵]. دمای محلول پرایمینگ می ­تواند بر مدت زمان پرایمینگ موثر باشد[۱۵۰]. دمای پرایمینگ بر حسب نوع گونه متفاوت خواهد بود، ولی معمولا همان دمای اپتیمم برای جوانه­زنی می­باشد[۷۳].

۲-۲-۱۸-۸-۲- زمان
مدت زمان لازمی که بذرها در معرض محلول­های پرایمینگ قرار می­گیرد، در موفقیت یا عدم موفقیت آزمایش نقش بسیار مهمی را بازی می­ کند. زیرا زمان به عنوان پارامتری بسیار تأثیر گذار در فازهای جوانه زنی مطرح می باشد. مدت زمان لازم برای هرگونه و توده بذر متفاوت بوده و یکی از اهداف اصلی انجام تحقیقات پرایمینگ بر روی گونه­ های مختلف، یافتن مدت زمان تیمار مطلوب با در نظر گرفتن سایر عوامل تأثیر گذار می­باشد[۵].
۲-۲-۱۸-۸-۳- خشک کردن بذر
اگرچه اثرات بسیاری از عوامل محیطی بر موفقیت پرایمینگ موثر است، ولی عمل خشک کردن بذرهای پرایمینگ شده یک مرحله بحرانی می­باشد[۱۳۴]. دی هیدراته کردن بذرهای پرایم شده، اغلب به دلیل حمل و نقل، کشت و ذخیره سازی و امکان آسیب دیدن بذرهای مرطوب، غیر قابل اجتناب بوده، ممکن است سبب کاهش اثرات پرایمینگ شود[۱۱۲]. نوع دیگری از پرایمینگ به نام پرایمینگ در مزرعه تکوین یافته است، که شامل خیساندن بذرها در آب (به مدت ۲۴ ساعت) و سپس خشک کردن سطحی و کشت در همان روز است[۵].
یکی دیگر از عوامل تأثیر گذار بر پرایمینگ مقدار اکسیژن لازم در زمان پرایمینگ می­باشد. گاهی برای اکسیژن رسانی به بذرها حین عمل پرایمینگ، از پمپ­های هوادهی برای این منظور استفاده می شود. بیش از ۵ درصد اکسیژن در زمان پرایمینگ، جهت انجام فرایندهای متابولیکی و سنتز لازم می­باشد[۵].
۲-۲-۱۹- باکتری­ های افزاینده رشد گیاهی PGPR (Azospirillum spp)
۲-۲-۱۹-۱- تاریخچه
اولین بار بیجرنیک^[۸۷] در سال ۱۹۲۲ رشد باکتری­ های اسپیریل مانند در محیط کشت مالات یا لاکتات فاقد نیتروژن که با خاک باغچه آغشته شده بود، را مشاهده نمود. برخلاف محیط کشت حاوی کربوهیدرات، محیط کشت دارای اسیدهای آلی موجب رشد باکتری­ های Spirillum بدون افزایش رشد سایر باکتری­ های تثبیت کننده نیتروژن مانند Azotobacter و Clostridium می‌گردد. بیجرنیک دریافت که کشت­های نسبتاً خالص Spirillum با مصرف مالات موجب افزایش نیتروژن محیط کشت شدند در صورتی که کشت­های فاقد Spirillum قادر به نشان دادن چنین افزایشی نمی­باشند. به طور کلی، سلول­های کشت شده در محیط قندی، ضخیم، میله­ای خمیده و محتوای ذرات لیپیدی زیادی هستند. در محیط کشت آگار مالات یا لاکتات، سلول­های باکتری نازکتر و راستتر بوده، در صورتی که در محیط بویلون رقیق به شکل اسپیریل منفرد با یک یا چند تاب مارپیچی می­باشند. به دلیل سهولت کشت بر اسیدهای آلی و ظهور شکل اسپیریل تحت شرایط معین، بیجرنیک گزارش نمود که این ارگانیسم جزء اعضای جنس Spirillum می‌باشد و یک ارگانیسم ارتباط دهنده است که جنس Spirillum را با جنس Azotobacter پیوند می­دهد. او ابتدا این ارگانیسم را Azotobacter spirillum نامید اما بعدها آن را به Spirillum lipoferum تغییر نام داد[۸].
مطالعات بعدی انجام گرفته بر باکتری Spirillum lipoferum توسط شرودر^[۸۸] (۱۹۳۲) موجب رد فرضیه تثبیت نیتروژن توسط کشت­های خالص این باکتری شد[۱۷۲]. در سال ۱۹۶۳ بکینگ^[۸۹] یک ارگانیسم شبیه به Spirillum lipoferum که توانایی فعالیت نیتروژناز را نشان داد جداسازی نمود[۵۱]. ده سال بعد فاویلی^[۹۰]، دیازتروف­های جداسازی شده از خاک­های ایتالیا، مانند Spirillum lipoferum را شناسایی و نشان داد که قادر به تثبیت نیتروژن در کشت­های خالص با بهره گرفتن از یک محیط مایع محتوای مقدار کمی از عصاره مخمر می‌باشند[۸۰].
جداسازی گسترده باکتری Azospirillum در سراسر جهان و مخصوصاً از ریشه گراس­های مناطق گرمسیر را می­بایست به محیط کشت مالات نیمه­جامد فاقد نیتروژن معرفی شده توسط دابرینر^[۹۱] نسبت داد. در این محیط کشت، رشد باکتری در عمق­های مختلف آن به صورت غوطه­ور دیده می­ شود. این محیط، رشد زیاد این باکتری­ ها را ممکن می­سازد زیرا باکتری­ ها می­توانند از نیتروژن مولکولی به عنوان تنها منبع نیتروژن تحت شرایط میکروآئروبیک^[۹۲] (فشار اکسیژن کم) استفاده کنند[۸].
مطالعات فیزیولوژیکی، اکولوژیکی و ژنتیک مولکولی مفصلی که روی این باکتری­ ها و بویژه گونه A. brasilense صورت گرفته نشان داد که باکتریAzospirillum یکی ازسودمندترین باکتری­ های ریزوسفری است.
۲-۲-۱۹-۲- طبقه ­بندی
جنس Azospirillum متعلق به زیر خانواده α از پروتئوباکترها^[۹۳] و از خانواده اسپیریلاسه۷ می­باشد. این زیر رده تعدادی زیادی از باکتری­ های همیار گیاهی و همزیست نظیر ریزوبیوم (Rhizobium)، برادی­ریزوبیوم (Bradyrhizobium) و اگروباکتریوم (Agrobacterium) یا گلوکوناستوباکتر (Gluconacetobacter) را در برمی­گیرد. جنس­های دیگر این خانواده اکواسپیریلوم (Aquaspirillum)، هرباسپیریلوم (Herbaspirillum) و کامپیلوباکتر (Campylobacter) می‌باشند. در همه این جنس­ها، گونه ­هایی وجود دارند که قادر به تثبیت نیتروژن مولکولی هستند.
بر اساس توالی نوکلئوتیدها در ۱۶S rRNA گونه­ های Azospirillum شناسایی شده ­اند. آزوسپیریلوم برازیلنس (A. brasilense)، آزوسپیریلوم لیپوفروم ( A. lipoferum)، آزوسپیریلوم دابرینر (A. doebereinerae)، آزوسپیریلوم لارجیموبایل (A. largimobile) و آزوسپیریلوم هالوپرافرنس (A. halopraeferens) زیر گروه اول را تشکیل، در حالی که آزوسپیریلوم ایراکنس (A. irakense)، آزوسپیریلوم آمازوننس ( A. amazonense) و رودسیستا (Rhodocista) زیر گروه دوم را تشکیل می­ دهند و گزارش شده که اسکرمانلا (Skermanella) نیز زیر گروه سوم را تشکیل می­دهد[۸].
درصد مولی بازهای سیتوزین و گوانین DNA این گونه­ ها بین ۶۴-۷۱ می­باشد. شباهت توالی ۱۶S rDNA بین گونه­ های مختلف در حدود ۶/۹۳-۶/۹۶ درصد در داخل یک زیر گروه و ۶/۹۰-۲/۹۰ درصد بین اعضای گونه­ های دو زیر گروه می­باشند.
تاکنون نه گونه از این باکتری شناسایی شده است (جدول۲-۳).
جدول ۲-۲- گونه­ های مختلف باکتری sp Azospirillum[8]