۱۵ثانیه

۱۹-اتانول۱۰۰%

۱۵ثانیه

نکته:
۱- اتانول اسیدی: اضافه کردن ۱میلی لیتر هیدروکلریک اسید غلیظ به ۲۰۰میلی لیتر اتانول ۷۰%.
۲- قبل از پوشاندن با چسب ۱ دقیقه در محلول زیلن-اتانول که دارای نسبت یک به یک هستند قرار داده می شود.
۳- ۱ دقیقه در محلول زیلن ۱۰۰% برای شفاف شدن قرار داده می شود.

۴- سپس در وسط لام چسب انتلان قرار داده می شود و روی آن را لامل بزرگ mm50×۲۴ قرار داده می شود.
۵- بعد توسط میکروسکوپ با بزرگنماییX100 حداقل ۱۰۰ اسپرم مورد مطالعه قرار می گیرد تا بتوان درصد اسپرم های طبیعی را بیان نمود.
نمونه ای از نظر مورفولوژی سالم است که سر بیضی شکل با ابعاد ۵×۵/۲ میکرون و حدود ۷۰% آکروزوم واضح و یکنواخت در سمت قدامی سر باشد. در ضمن بایستی دارای گردن سالم و بدون نقایص آناتومی با دم دراز و کشیده باشد. در صد اسپرم های طبیعی قبل و بلافاصله بعد از Swin-up Direct بررسی وثبت گردید (WHO 2010).
۲-۳-۳- Direct swim-up
از این روش برای شسشوی نمونه های نرمال^[۸۸] برای استفاده در تکنیک IUI مورد استفاده قرار می گیرد.
۲-۳-۳-۱- روش کار
۱- به میزان ۲/۱ میلی لیتر محیط کشت اسپرم درون لوله فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته می شود و سپس ۱ میلی لیتر از نمونه به وسیله ی پیپت پاستور از ته اضافه می شود.
۲- لوله فالکون با زاویه ۴۵ درجه به مدت یک ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده می شود.
۲-۴-چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه ۴۵ درجه در انکوباتور
۳- سپس ۳/۲ مایع رویی که حاوی اسپرم های متحرک با مورفولوژی خوب هست جدا شده و داخل یک لوله آزمایش ریخته می شود.
۴- ۵/۱ تا ۲ سی سی محیط کشت اسپرم به تست تیوپ اضافه می شود و به مدت ۵ دقیقه با دور ۵۰۰-۳۰۰g سانتریفوژ می شود.
۵-بعد از سانتیریفیوژ ۵/۰ میلی لیتر محیط کشت اسپرم ته لوله روی رسوب تشکیل شده باقی گذاشته و سپس رسوب درون محیط کشت اسپرم باقی مانده حل می شود(WHO 2010).
۲-۳-۴- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)
یکی از روش های بررسی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم^[۸۹] با این روش می باشد که باید بر روی نمونه تازه صورت گیرد.
۱-۳-۴-۱- روش کار
۱-ابتدا آگارز^[۹۰] استاندارد با غلظت ۶۵/۰درصد آماده می شود سپس آگارز را در مایکروفر گذاشته تا آگارز ذوب شده و شفاف گردد، بعد یک لام لیبل دار برداشته و داخل آگارز ذوب شده می شود و بیرون کشیده می شود تا یک لایه آگارز روی لام قرار گیرد سپس پشت لام با دستمال از آگارز تمیز می شود همچنین می شود با بهره گرفتن از سمپلر آبی آگارز برداشته شود و بر روی تمام نقاط لام ریخته می شود، ضخامت آگارز روی لام باید کم باشد، بعد در دمای محیط گذاشته می شود تا آگارز روی لام ببندد.
۲- آگارز با نقطه ذوب پایین^[۹۱] با غلظت ۱ درصد ساخته می شود سپس در مایکروفر گذاشته تا آگارز با نقطه ذوب پایین ذوب شده و شفاف گردد.
۳- با سمپلر ۷۰ میکرو لیتر آگارز با نقطه ذوب پایین برداشته ودرون یک میکروتیوپ ریخته می شود، بعد با سمپلر ۳۰ میکرو لیتر نمونه را برداشته و داخل میکروتیوپ ریخته می شود سپس آگارز با نقطه ذوب پایین با نمونه مخلوط کرده؛ بعد ۵۰ میکرولیتر از این مخلوط را با سمپلر روی لامی که آگارز معمولی بود ریخته می شود و بعد برروی آن یک لام بزرگ mm)50×۲۴) قرار داده می شود و به مدت ۴ دقیقه در یخچال نگه داری می شود تا ببندد.
۴- سپس لامل به صورت موازی با سطح لام کشیده می شود تا لامل از لام جدا شود.
۵- بعد لام درون محلول HCl 08/0 نرمال به مدت ۱۷ دقیقه در تاریکی قرار داده می شود.
۶- لام به مدت ۱۰ دقیقه در محلول شماره یک در دمای اتاق قرار داده می شود، محلول شماره یک چون داری مرکاپتواتانول می باشد در زیرهود این کار را انجام می شود.
۷- لام به مدت ۱۵ دقیقه در محلول شماره دو در دمای اتاق قرار داده می شود.
۸- سپس لام را به مدت ۲ دقیقه در محلول شماره سه در دمای اتاق قرار داده می شود.
۹- بعد لام در سری های الکل ۷۰ درصد،۹۰ درصد و۱۰۰ درصد هر کدام به مدت ۲ دقیقه قرار داده می شود. این کار برای آبگیری از نمونه ها لازم می باشد. استفاده از سری های الکل برای آبگیری به این دلیل است که فرایند آبگیری آهسته انجام شود و سلول به یکباره آسیب نبیند.سپس لام در دمای اتاق گذاشته می شود تا خشک شود.
۱۰- در داخل یک لوله رنگ رایت با محلولPBS به نسبت یک به یک مخلوط می شود، سپس این مخلوط با سمپلر بر روی تمام لام ریخته می شود و به مدت ۱۰ دقیقه زمان داده می شود.
۱۱- لام در آب روان قرار داده می شود تا زمانی که آب شفاف شده و اثری از رنگ رایت در آب دیده نشود.
۱۲- لام در مجاورت هوا قرار داده می شود تا خشک شود.
۱۳-حال لام برای آنالیز از نظر قطعه قطعه شدن DNA آماده شده است، لام آماده شده با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 بررسی می شود و تعداد ۱۰۰ اسپرم شمارش می شود و میزا ن سلول هایی که دچار قطعه قطعه شدن DNA شدند به صورت درصد بیان می شود، قطعه قطعه شدن DNA بر اساس تشکیل هاله در اطراف سر اسپرم به ۴ حالت می باشد که عبارتنداز(Fernandez, et al., 2003):
۱-هسته اسپرم با هاله بزرگ ( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
۲-هسته اسپرم با هاله متوسط( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
۳-هسته اسپرم با هاله کوچک( دارای قطعه قطعه شدن DNA)
۴-هسته اسپرم بدون هاله(دارای قطعه قطعه شدن DNA)
۲-۳-۵- روش رنگ آمیزی تانل
ابتدا غلطت نمونه شسته شده به ۲۰ میلیون رسانده و اسمیر تهیه می شود. پس از خشک شدن اسمیر ها در دمای اتاق مراحل زیر به ترتیب انجام می شود :
۱-فیکس کردن اسمیرها : الف)پارافرمالدهید ۴% در PBS با PH=7.4 (بمدت ۲۰ دقیقه در دمای ۱۵ تا ۲۵ سانتیگراد).
ب) یا در متانول ۱۰۰% بمدت ۴ دقیقه (نگهداری طولانی مدت در فریزر).
۲-لام های فیکس شده در جا لامی گذاشته و آنها به مدت ۳۰ دقیقه در محلول (×۱) PBS که از قبل تهیه شده قرار داده می شود. نقش PBS شستشوی نمونه می باشد.
۳-انکوباسیون با محلول blocking ( H₂O₂ ۳% در متانول) بمدت ۱۰ دقیقه در دمای ۱۵ تا ۲۵ سانتی گراد صورت می گیرد.
۴-سپس با PBS به مدت ۵ دقیقه شستشو داده می شود.
۵-انکوباسیون با محلول تریتون ۱/۰ درصد در سدیم سیترات ۱/۰ درصد این محلول باید به صورت تازه ساخته شود و روی یخ بمدت ۲ دقیقه در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتیگراد صورت می گیرد ، تریتون باعث نفوذ پذیری غشای سلول ها می شود.
۶- سپس با PBS به مدت ۵ دقیقه شستشو داده می شود.
۷-محلول TUNEL بمدت ۱ ساعت در محیط تاریک، مرطوب و دمای ۳۷ درجه قرار داده می شود. این محلول طبق پروتکل کیت مصرفی تهیه می شود به این صورت که کیت را که در فریزر نگهداری می شود را بیرون آورده می شود و به مدت یک الی دو دقیقه در محیط گذاشته تا از حالت یخ به صورت مایع تبدیل شود. بعد برای هر لام، ۵ میکرو لیتر محلول آنزیم و ۴۵ میکرو لیتر محلول لیبل درون یک میکروتیوپ با هم مخلوط می شود و به تمام قسمت های لام ریخته می شود. ظرف مستطیل شکل بزرگی برداشته، دو میله به صورت موازی در آن گذاشته می شود و لام ها روی میله ها چیده می شود، کمی آب مقطر ته ظرف ریخته می شود تا مرطوب بماند، پس از گذاشتن در ظرف، ظرف به مدت یک ساعت درون انکوباتور قرار داده می شود تا واکنش های مربوطه صورت گیرد.
۸- سه مرتبه به وسیله ی PBS، هر مرتبه به مدت ۵ دقیقه شستشو داده می شود.
۹-سپس انکوباسیون با converter – probe بمدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه صورت می گیرد.